影响凝胶聚合的因素

1） Acr及Bis的纯度：应选用分析纯的Acr及Bis，如试剂不纯，含有杂质或丙烯酸时，则凝胶聚合不均一，或聚合时间延长甚至不聚合， 因而需进一步纯化。 Acr和Bis贮液的pH值为4.9-5.2，当pH值的改变大于0.4pH单位则不能使用，因在偏酸或偏碱的环境中，它们可不断水解放出丙烯酸和NH4+ 而引起pH值改变，从而影响凝胶聚合。 因此，配制的Acr和Bis贮液应置棕色瓶中，4℃贮存 ，存放期一般不超过1-2个月为宜。

2）AP、核黄素、TEMED：增加AP和TEMED可加快聚合速率，但过量的AP和TEMED会引起电泳时烧胶和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。

3）pH：碱性条件下聚合快，但碱性过强时胶硬而脆，需高pH时应减少AP和TEMED用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。

4）温度：温度高聚合快，但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温(5℃)聚合凝胶会变得脆而混浊，一般25-35℃聚合较好。

5）氧分子：氧分子阻碍凝胶聚合，故不含SDS的凝胶先抽真空脱气，再加引发剂。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定相对分子质量、等电点等。 聚丙烯酰胺凝胶电泳又有以下几种：

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

连续密度梯度电泳

聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳

聚丙烯酰胺凝胶双向电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳 （DNA序列分析）

1 仪器： PCR扩增仪（96孔）、序列分析电泳槽：DYCZ-20C\DYCZ-20G、高压电源：DYY-10C或DYY-12型 水平摇床（WD-9405D）、电子天平 (精确1毫克) 、移液枪：WD-2108 、双显磁力搅拌器、高压蒸汽灭菌锅、pH计、水浴锅、高速台式冷冻离心机、微型离心机：WD-2105A/B等

2 实验试剂： 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、Tris碱、10×Buffer、 dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、去离子甲酰胺、溴酚蓝 、 二甲苯青FF、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、硼酸、尿素、 亲和硅烷、剥离硅烷、四甲基乙二胺、过硫酸铵、硝酸银 、DNA Marker(根据PCR片段大小选择合适的Marker范围， 如SSR实验的范围在100bp—400bp之间)

聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶 所谓非变性凝胶，即在凝胶中不加SDS和巯基乙醇等变性剂，这种凝胶中，蛋白质仍保持活性，其迁移率受它的静电荷与分子大小两个因素的影响。因此在非变性凝胶中进行电泳是不能测得分子量的，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。 所谓变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺酸钠)、巯基乙醇、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋白质在这种变性凝胶中的迁移率与它们分子量的对数成直线关系。因此利用变性凝胶进行电泳可以测得蛋白质的分子量。目前应用较多的变性剂为SDS。

标签：