DYCZ - 26B双向电泳仪第二向电泳分辨率低的困境

作者：六一生物发布时间：2025-01-22 09:26:21 点击：

在运用DYCZ - 26B双向电泳仪进行蛋白质组分析时，第二向电泳的分辨率至关重要，它直接关系到我们能否准确分离和鉴定蛋白质。然而，在实际操作中，常常会遭遇第二向电泳分辨率低的难题，这无疑给科研工作带来了极大的困扰。下面，我们将深入剖析DYCZ - 26B双向电泳仪这一问题产生的原因，并为大家提供行之有效的解决办法。

一、凝胶浓度选择不当

1. 原因：凝胶浓度对蛋白质的分离起着关键作用。如果凝胶浓度过高，孔径过小，大分子量的蛋白质难以在凝胶中迁移，可能导致条带聚集在一起，无法有效分离，从而降低分辨率。相反，若凝胶浓度过低，孔径过大，蛋白质迁移速度过快，同样无法实现良好的分离效果。例如，对于分子量范围较广的蛋白质样本，如果统一使用高浓度凝胶，较小分子量的蛋白质可能会迅速迁移至凝胶底部，而大分子量蛋白质则难以移动，最终使条带分布集中，分辨率降低。

2. 解决办法：在进行第二向电泳前，根据第一向电泳分离出的蛋白质分子量范围，精确选择合适的凝胶浓度。可以通过查阅相关文献或进行预实验，确定不同分子量蛋白质所适用的凝胶浓度。一般而言，对于小分子量蛋白质，可选择较高浓度的凝胶（如15% - 20%聚丙烯酰胺凝胶）；对于大分子量蛋白质，较低浓度的凝胶（如8% - 12%聚丙烯酰胺凝胶）更为合适。若样本中蛋白质分子量分布较广，可考虑采用梯度凝胶，即凝胶浓度从顶部到底部逐渐增加，以适应不同分子量蛋白质的分离需求。

二、凝胶聚合不均匀

1. 原因：凝胶聚合过程受到多种因素影响，如温度、引发剂（如过硫酸铵和TEMED）的用量和混合均匀度等。若温度不稳定，局部温度过高或过低，会导致凝胶聚合速度不一致。引发剂用量不准确或混合不充分，也会使凝胶在不同区域的聚合程度不同，出现局部疏松或紧密的情况。这些都会导致凝胶内部结构不均匀，影响蛋白质的迁移路径，降低分辨率。

2. 解决办法：将凝胶制备过程控制在稳定的环境温度下，一般20 - 25℃较为适宜。准确称量引发剂的用量，并在加入引发剂后迅速、充分地搅拌均匀，确保引发剂在凝胶溶液中均匀分布。在凝胶聚合过程中，尽量避免震动和温度波动，可将其放置在平稳的环境中。另外，可在凝胶溶液中添加适量的甘油，甘油不仅能增加溶液的密度，有助于凝胶的灌制，还能使凝胶聚合更加均匀，提高分辨率。

三、凝胶平衡不充分

1. 原因：第一向电泳后的胶条在进行第二向电泳前，需要进行平衡处理，以确保蛋白质能够顺利进入第二向凝胶并保持良好的分离状态。若平衡时间过短，蛋白质未能充分与平衡缓冲液中的成分相互作用，其电荷状态和构象可能未得到充分调整，导致在第二向凝胶中的迁移异常，分辨率降低。而平衡时间过长，可能会使蛋白质从胶条中扩散出来，同样影响分离效果。

2. 解决办法：严格按照实验方案要求的时间进行凝胶平衡。一般来说，平衡时间可分为两步，第一步使用含有DTT（二硫苏糖醇）的平衡缓冲液，使蛋白质的二硫键充分还原，时间约为15 - 20分钟；第二步使用含有碘乙酰胺的平衡缓冲液，对还原后的巯基进行烷基化修饰，时间也为15 - 20分钟。在平衡过程中，要确保胶条完全浸没在平衡缓冲液中，并轻轻晃动，使缓冲液能够充分与胶条接触，保证平衡效果的一致性。

四、电压与电流设置不合理

1. 原因：电压和电流是驱动蛋白质在凝胶中迁移的动力来源。电压过低或电流过小，蛋白质在凝胶中的迁移速度缓慢，可能无法在规定时间内实现充分分离，导致条带分辨率低。然而，过高的电压或电流会使凝胶产生过多热量，引起蛋白质变性，同时也会导致凝胶温度不均匀，影响蛋白质的迁移路径，同样降低分辨率。例如，电压过高时，蛋白质可能会因过热而发生聚集，形成拖尾现象，破坏条带的清晰度和分辨率。

2. 解决办法：通过预实验，结合样本的性质和凝胶的类型，确定合适的电压和电流参数。在开始实验时，可采用较低的电压或电流进行一段时间的预电泳，使蛋白质在凝胶中初步定位，同时让凝胶适应电场环境。然后，逐渐提高电压或电流，加快蛋白质的迁移速度，但要密切关注凝胶的温度变化，避免过热。一般来说，可将电压设置在100 - 300V之间，根据实际情况进行调整。同时，使用带有冷却装置的电泳槽，将电泳温度控制在15 - 20℃，以保证蛋白质在适宜的环境中迁移，提高分辨率。

五、电泳时间控制不当

1. 原因：电泳时间过短，蛋白质未能在凝胶中迁移到足够的距离，无法充分分离，分辨率自然较低。而电泳时间过长，蛋白质可能会跑出凝胶底部，或者在凝胶中发生扩散，导致条带变宽、模糊，同样降低分辨率。例如，对于某些复杂的蛋白质样本，需要较长的电泳时间才能实现良好的分离，但如果不加以控制，过长的时间会使条带质量下降。

2. 解决办法：在实验前，通过查阅相关文献或参考类似实验的经验，预估大致的电泳时间。然后在正式实验中，结合指示剂（如溴酚蓝）的迁移情况，实时调整电泳时间。当指示剂迁移至距离凝胶底部1 - 2cm处时，可考虑停止电泳。同时，记录每次实验的电泳时间和结果，通过对比分析，逐渐摸索出针对不同样本的最佳电泳时间，以提高第二向电泳的分辨率。

六、样本降解与杂质污染

1. 原因：在样本制备、储存和处理过程中，如果操作不当，可能会导致蛋白质样本降解。例如，样本在提取过程中未在低温环境下进行，或者保存时温度过高、反复冻融，都会使蛋白质的结构遭到破坏。此外，样本中若含有杂质，如核酸、多糖等，这些杂质会与蛋白质相互作用，影响蛋白质在凝胶中的迁移，降低分辨率。比如，核酸可能会与蛋白质形成复合物，改变蛋白质的迁移特性。

2. 解决办法：优化样本制备和保存条件。在样本提取过程中，尽量在低温环境下操作，如在冰上进行，并添加适量的蛋白酶抑制剂，防止蛋白质降解。样本保存时，将其置于 - 80℃冰箱中，并避免反复冻融。对于样本中的杂质，可通过离心、过滤或使用核酸酶等方法进行去除。例如，在样本提取后，可通过高速离心去除不溶性杂质，再使用核酸酶消化去除核酸杂质，以提高样本的纯度，保证第二向电泳的分辨率。

七、样本上样量不合适

1. 原因：上样量过多，蛋白质在凝胶中过于拥挤，会导致条带拖尾、变形，甚至出现条带重叠的现象，严重降低分辨率。相反，上样量过少，蛋白质条带信号过弱，难以准确分辨，同样影响分辨率。例如，当大量蛋白质同时进入凝胶时，它们之间的相互作用会干扰其正常迁移，导致条带分离效果不佳。

2. 解决办法：通过预实验确定合适的上样量。可以设置不同的上样量梯度，如10μg、20μg、30μg等，观察条带的分离效果和清晰度。根据样本的浓度和蛋白质的丰度，选择既能保证条带清晰可见，又能实现良好分离效果的上样量。同时，在每次上样时，确保上样量的准确性，可使用高精度的移液器进行操作。

当DYCZ - 26B双向电泳仪第二向电泳出现分辨率低的问题时，通过对凝胶制备与处理、电泳条件与参数设置以及样本处理与保存等方面进行全面、细致的排查和优化，能够有效提高分辨率，为蛋白质组研究提供更准确、可靠的实验结果。科研之路充满挑战，只有不断探索和改进实验方法，注重每一个细节，才能在科学研究中取得更有价值的成果。

本文由北京六一生物编辑整理。

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